BAB XI Polymerase Chain Reaction (PCR)

Di dalam bab ini akan dibahas pengertian dan kegunaan teknik Reaksi Polimerisasi Berantai atau Polymerase Chain Reaction (PCR) serta komponen-komponen dan tahapan reaksinya. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:

1.      pengertian dan kegunaan PCR,

2.      komponen-komponen PCR,

3.      tahapan PCR, dan

4.      dasar-dasar perancangan primer

Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah dasar-dasar teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan genom, yang masing-masing telah dibicarakan pada Bab IX dan X.

Pengertian dan Kegunaan PCR

Pada bagian akhir Bab IX telah disinggung bahwa fragmen pelacak yang diperlukan dalam seleksi rekombinan merupakan molekul DNA untai ganda yang urutan basanya harus komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dilacak. Fragmen pelacak ini dibuat secara in vitro menggunakan teknik PCR. Namun, teknik yang ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1987 ini, tidak hanya digunakan untuk membuat fragmen pelacak, tetapi secara umum teknik ini merupakan cara untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in vitro.

Komponen dan Tahapan PCR

Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.

DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.

Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2ⁿ – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).

Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 2²⁰ – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

                           Gambar 12. 1. Putaran pertama PCR                                           

Perancangan Primer

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.

Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.

Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.

Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).

Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (T_m) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai T_m yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.